GEMIN4, une cible thérapeutique potentielle pour les patientes atteintes d’un cancer du sein de type basal | BMC Women’s Health

 GEMIN4, une cible thérapeutique potentielle pour les patientes atteintes d’un cancer du sein de type basal | BMC Women’s Health

Source des données et préparation

Les données du Molecular Taxonomy of Breast Cancer International Consortium (METABRIC) ont été téléchargées à partir de cBioportal (http://www.cbioportal.org/) [10]. Plus précisément, sélectionnez l’élément Breast sur la page d’accueil de la base de données du cbioportail, L’ensemble de données sur le cancer du sein (METABRIC, Nature 2012 &amp ; Nat Commun 2016) a été sélectionné dans la colonne des carcinomes mammaires invasifs pour être téléchargé. 1 898 patients atteints de CB (199 BCBL et 1 699 autres sous-types, y compris normal-like, Her2-enriched, claudin-low, luminal A ainsi que luminal B) avec des profils d’expression, des données de survie ainsi que des caractéristiques cliniques ont été inclus dans la recherche actuelle. Les gènes codant pour les protéines humaines ont été annotés selon le GENECODE (https://www.gencodegenes.org/) et ont été inclus dans l’analyse ultérieure. Le tableau supplémentaire 1 présente les caractéristiques cliniques détaillées des patients BCBL et la figure 1 montre le déroulement de cette recherche.

Fig. 1
figure 1

Le déroulement de cette étude

Identification des modules génétiques liés à la BLBC via WGCNA

L’analyse WGCNA a été appliquée pour regrouper les gènes de chaque sous-type de CB sur la base de leur matrice d’expression génique. La puissance de seuil souple appropriée pour la construction du réseau a été fournie en calculant l’indice d’adéquation de la topologie sans échelle pour plusieurs puissances à l’aide du progiciel R « WGCNA ». [11]. Dans les sous-types de CB, les interactions entre les gènes ont été calculées à l’aide des valeurs de signification des gènes (GS), et l’appartenance à un module (MM) a indiqué l’importance des modules dans les profils d’expression des gènes. Au total, 913 gènes candidats du « module rouge » présentant les coefficients de corrélation les plus élevés ont été sélectionnés pour une analyse ultérieure. Au total, 913 gènes candidats présentant les coefficients de corrélation les plus élevés ont été sélectionnés dans le « module rouge » en vue d’une analyse ultérieure.

Analyse de l’enrichissement fonctionnel des gènes candidats sélectionnés dans le « module rouge » associés au BCBL

La boîte à outils d’analyse des ensembles de gènes basée sur le web (WebGestalt) (http://www.webgestalt.org/) [12] a été utilisé pour l’analyse d’enrichissement GO (y compris fonction moléculaire (MF), composant cellulaire (CC), ainsi que processus biologique (BP) et voie KEGG des gènes candidats liés à la BLBC dans le module rouge. L' »analyse de surreprésentation » (ORA) a été sélectionnée comme « méthode d’intérêt ». Les résultats ont été visualisés à l’aide des logiciels R « ggplot2 » et « ggpubr ».

Identification des DEG entre le BLBC et d’autres sous-types de CB

Les DEGs entre le BLBC et chacun des autres sous-types ont été identifiés séparément par le package R « limma ». Les gènes ayant une valeur log2 de changement de pli (FC) &gt ; 0 ainsi que les gènes ayant une valeur log2 de changement de pli (FC) &gt ; 0 ont été identifiés. p 0,05 après ajustement pour le FDR ont été considérés comme des gènes régulés à la hausse (URGs). Nous avons ensuite recoupé les URGs qui se chevauchaient dans chaque résultat et identifié 1 893 URGs dans le BLBC par rapport aux autres sous-types de CB. Ces URG ont ensuite été comparés aux 913 gènes du « module rouge » identifiés par le WGCNA. Enfin, 386 gènes candidats communs ont été identifiés pour le BLBC.

Construction et vérification de la valeur pronostique des 386 gènes candidats associés à la leucémie myéloïde chronique (BLBC)

La signification pronostique de ces gènes candidats a été évaluée par une régression de Cox univariée réalisée par le package R « survival ». Sur la base de la valeur médiane d’expression des 386 gènes candidats, les patients atteints de BLBC ont été séparés en groupes à faible risque et à haut risque, et la différence de SG et de SGR entre les deux groupes a été étudiée. Les gènes ayant un rapport de risque (HR) &gt ; 1 et p 0,05 ont été considérés comme un facteur de risque pour le BLBC et ont été sélectionnés pour une étude de suivi.

Analyse de la fonction biologique de GEMIN4 dans les lignées cellulaires de BLBC

Fortement exprimé GEMIN4 est apparue comme étant liée à la mauvaise OS et RFS des BLBC. L’expression moyenne de GEMIN4 dans les lignées cellulaires BLBC ont été téléchargées à partir de la base de données Depmap (https://depmap.org/portal/) et comparées à la lignée cellulaire CRISPR, les données de criblage de l’interférence ARN (ARNi) afin d’analyser l’impact de l’interférence ARN (ARNi) sur les cellules de la lignée cellulaire. GEMIN4 sur la capacité de croissance des lignées cellulaires BLBC.

Mécanisme moléculaire de GEMIN4 dans la progression de la BLBC

Selon l’expression médiane de GEMIN4 chez 199 patients atteints de BLBC, les cas ont été séparés en groupes régulés à la hausse et à la baisse pour l’analyse bayésienne à l’aide du progiciel R « limma ». Les valeurs t bayésiennes de chaque DEG (P 0,05) ont été obtenus pour l’analyse des voies de signalisation GO et KEGG.

Culture cellulaire

Les lignées cellulaires BLBC, y compris HCC1143 et CAL120, ont été cultivées dans un milieu DMEM (C11995500CP) avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) (10,091,148) et 100U/mL Pen/Strp (15,070,063). Les réactifs et les milieux proviennent de Gibco, USA. Toutes les cellules ont été fécondées dans un incubateur de 37℃ avec 5% de CO2. Les cellules ont été transfectées avec l’ARNsi lorsque la confluence cellulaire atteignait environ 80 %. Après 48 heures de transfection, les cellules ont été prélevées pour analyse.

Transfection transitoire du petit ARN interférent (siRNA) GEMINR

Le GEMIN4 siRNA (si-GEMIN4) et les contrôles négatifs (si-NC) provenaient de GenePharma (Shanghai, Chine). La transfection des siARN avec la Lipofectamine 30 000 (L3000001, Invitrogen, USA) a suivi les instructions du fabricant, les étapes brèves étant les suivantes : lorsque la confluence des cellules atteint environ 80 %, mélanger 20 uL de si-GEMIN4 ou de si-NC avec 5 uL de Lipo3000 et laisser reposer pendant 20 minutes, puis ajouter le mélange dans le milieu de culture. Après 48 h, laisser tomber le milieu de culture et laver les cellules avec du PBS 1 × froid trois fois, puis collecter les cellules pour l’analyse suivante.

RT-qRCR

Le réactif RNAiso Plus (9108, Takara, Japon) a été utilisé pour extraire les ARN totaux, et transcrit à l’envers en ADNc à l’aide du kit PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit (6110A, Takara, Japon) en suivant les instructions du fabricant. Ensuite, la RT-qPCR a été utilisée avec les prémélanges TB Green Advantage qPCR (639,676, Takara, Japon). La RT-qPCR a été réalisée comme suit : 95 ℃ pendant 15 s, 60 ℃ pendant 20 s et 72 ℃ pendant 15 s, puis répétition du cycle pendant 35 cycles. Les cycles seuils (Cts) de chaque échantillon ont été détectés par le système Bio-rad CFX Opus 384 et chaque échantillon a été chargé et détecté au moins trois fois. Les Cts des échantillons ont été normalisés par rapport aux Cts de la GAPDH avec 2-∆∆Ct méthodes.

Test MTT pour la détection de la prolifération cellulaire

Les cellules ont été comptées après digestion à la trypsine, ensemencées dans des plaques à 96 puits avec 3 000 cellules par puits et 6 trous parallèles dans chaque groupe, et cultivées dans un incubateur de 37℃ avec 5% de CO2 lorsque les cellules BLBC ont été cultivées avec l’expression la plus élevée et la plus faible de GEMIN4. La technique de transfection ci-dessus a été utilisée pour transfecter le siRNA.

Les cellules ont été réparties dans 96 puits et transfectées selon les protocoles du fabricant. Après 48 heures de transfection, le milieu a été changé pour un nouveau milieu de culture de 100 µl et 20 µl de réactif MTT (M1020, Solarbio, Chine) ont été ajoutés au nouveau milieu de culture, puis fertilisé à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 4 h. Ensuite, ajouter 110 µl de solution de Formazan dans chaque puits et détecter la densité optique (DO) à 490 nm.

Détection de la prolifération cellulaire

Les cellules ont été lavées trois fois avec 1 × PBS et fixées avec du PFA froid à 4 % pendant 10 minutes, puis pénétrées dans les cellules avec 0,5 % de Triton-X100 dans 1 × PBS pendant une demi-heure. Les cellules ont été fécondées par des solutions de BrdU (B8010, Solarbio, Chine) pendant 10 minutes, et les cellules colorées positives ont été calculées au microscope à fluorescence.

Analyse statistique

Toutes les expériences ont été répétées au moins cinq fois, les données étant exprimées en moyenne ± écart-type (ET). Utilisez le test t de Student à double queue ou le test de Mann Whitney pour analyser la signification statistique. Évaluer la signification statistique à l’aide du test des rangs logarithmiques. Une différence de &lt ; 0,05 par rapport à P est considérée comme statistiquement significative.


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